Comparison of Sampling Procedures for the Molecular Diagnosis of Leishmaniases.

The present work evaluates sampling protocols, storage procedures, and DNA purification methods for Leishmania spp. detection and quantification in different biological samples. The efficiency of three preservation solutions, a phosphate buffer solution, an ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer solution, and 70% ethanol, was compared in combination with three DNA extraction protocols: a commercial silica column kit, salting-out protein precipitation, and organic extraction with phenol-chloroform. Tissue samples from BALB/c mice experimentally infected with Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) braziliensis, or Leishmania (Leishmania) infantum were stored in the three preservation solutions and subsequently subjected to the three different DNA extraction methods. The extracted DNA was then used in real-time polymerase chain reaction (PCR) assays for the detection and quantification of parasite ribosomal small subunit DNA targets as well as mammalian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh) targets. The results of the optimized protocols showed that the DNA extraction method did not influence test quality, but DNA from samples preserved with the EDTA buffer solution produced higher amounts of target amplicons. Based on these results, we concluded that samples from suspected cases of leishmaniasis for submission to molecular diagnostic procedures should be preferentially preserved in EDTA, followed by any one of the DNA purification methods evaluated.

Estimativa do número mínimo de promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis necessário para a proliferação em sistema de cultivo em microplacas / Estimated minimum number of promastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis necessary for proliferation in a culture system in microplates

O diagnóstico de certeza da leishmaniose cutânea depende do encontro doagente etiológico. A técnica tradicional de cultura (TTC) realizada emtubosdemanda prolongada incubação, grande volume de meio de cultivo edeamostra. A técnica de microcultura (TMC) realizada em placas de 96poçosutiliza pequeno volume de meio de cultivo e de amostra, possibilitandorealizar diversos inóculos por amostra examinada. Ocrescimento de L. (V.) braziliensis (MHOM/84/LTB300) foi realizado nasduas técnicasobjetivando determinar o número mínimo de parasitasnecessários para aproliferação. A partir de diluições seriadas de suspensãocom L. (V.) braziliensis, foram obtidos inóculos em concentrações de 1x100 até1x103 para o cultivo. Na concentração de 1x103 foi observadaproliferação0arasitária a partir de 48 horas do cultivo. Um único parasita(1x100) foisuficiente para permitir a proliferação nas duas técnicas. Noinóculo de18concentração 1x101 a TTC atingiu 1x108 parasitas, porém aproliferação foi3observada primeiramente na TMC. Na concentração de 1x103 a TMC atingiu 2x108 parasitas. Concluiu-se que a TMC é uma estratégiaque permitiu ocultivo a partir de uma única forma flagelada. Novos estudosestão sendorealizados para avaliar a viabilidade da TMC na utilização comométododiagnóstico